摘要 目的 研究柠檬酸与热力协同杀菌效果及其毒性。方法 采用载体浸泡定量杀菌实验、模拟现场试验和动物毒性实验方法进行了实验室观察。结果 将浓度为20.68g/L柠檬酸水溶液加温至80℃，协同作用10min，对浸泡在其中的载体上枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭对数值＞3.00。将装入透析机管路中浓度20.68g/L柠檬酸水溶液加温至80℃，循环作用10min，对污染在管路中的枯草杆菌黑色变种芽孢的平均杀灭对数值＞3.00。该浓度柠檬酸水溶液对小鼠剂型经口毒性LD50值＞5000mg/kg（体重），对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为阴性。结论 浓度为20.68g/L柠檬酸水溶在加温至80℃条件下，具有良好的协同杀灭细菌芽孢的作用，该浓度柠檬酸水溶液属于无毒级物质。 关键词 柠檬酸；热力；协同杀菌作用；解读 柠檬酸是一种有机酸，其化学名为2—羟基丙烷—1,2,3—三羧酸，弱酸性。该化合物常用作食品添加剂，或腐蚀剂，具有一定抗菌作用。本研究旨在观察柠檬酸水溶液在热力协同作用下的杀菌效果，评价其用于血液透析机管路消毒的可能性，以替代服饰性强的过氧乙酸、次氯酸、甲醛等。为此，选择枯草杆菌黑色变种芽孢为指标菌，观察了浓度为20.68g/L柠檬酸水溶加温至80℃协同杀灭细菌芽孢的效果，同时进行了模拟现场消毒试验。先将实验结果报告如下。 1 方法 1.1 稳定性试验 将试验浓度的柠檬酸水浓度密封包装，一式3份置于37℃温箱存放90d。于存储前后取样检测柠檬酸含量，计算其下降率。 1.2 菌片制备 去枯草杆菌黑色变种（ATCC 9372）芽孢，按规范程序培养制备细菌芽孢悬液。用含1000mg/L胰蛋白胨生理盐水（TPS）将芽孢悬液稀释配置成含菌量为1×108~5×108cfu/ml试验浓度的芽孢悬液。取10μl芽孢悬液滴染于无菌脱脂白平纹布片（1.0cm×1.0cm）上，置37℃温箱内干燥，制成菌片备用。 1.3 中和剂鉴定试验 以枯草杆菌黑色变种芽孢为代表菌，设6组试验，按载体定量杀菌试验程序进行中和剂鉴定试验。试验结果，以6组不长菌，第3、4、5组组间菌数相差不超过10%，第1组不长菌远少于第2组，第2组菌数≥100cfu/片，试验连续重复3次结果一致，表明所用中和剂及其浓度适宜。 1.4 载体浸泡定量杀菌试验 将柠檬酸用于无菌标准硬水配置成浓度20.68g/L水溶液，以每1菌片5ml用量，将柠檬酸水溶液分装于无菌平皿内（阳性对照为无菌蒸馏水）。在水浴中将柠檬酸溶液加温至80℃，将芽孢菌片浸没于柠檬酸溶液中，作用至规定时间，取出菌片放入含有5ml中和剂试管中。中和作用10min，充分震荡洗脱，去1ml洗脱液接种培养，进行活菌计数，计算杀灭对数值。试管重复3次。 1.5 血液透析机管路模拟现场消毒试验 试验用费费森尤斯4008系列血液透析机，在其运行状态下将污染有枯草杆菌黑色变种芽孢（含菌量1×107~5×107cfu/ml）的柠檬酸溶液吸入透析机管路中，于透析机管路出液口留取样液作为消毒前阳性对照。保持透析管路在80℃条件下按消毒程序持续循环一个周期（约10min）,在管路出液口留取样液2ml作为消毒后实验组。消毒前后留取的样液均加入到装有中和剂试管内，中和作用10min，对样液进行活菌计数培养，计算杀灭对数值。实验重读10次。 1.6 毒性试验 1.6.1 毒性试验 选择体重22g昆明种小鼠20只，雌雄各半（由四川省中医药科学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK[川]2008—19.SPF级）。试验采用一次最大限度试验法，设5000mg/kg（体重）一个剂量组，实验前动物禁食16h，不限饮食水。用试验溶度的柠檬酸水溶液作为受试物，给药量按20ml/kg体重一次经口灌胃染毒。染毒后观察动物的一般状况、中毒症状及死亡情况。观察两周，称体重后处死动物并进行大体解剖，记录动物内脏的改变，计算LD50值，进行急性毒性分级。 1.6.2 骨髓嗜多染红细胞微核试验 选择成年清洁级昆明小鼠50只，随机分成5组，每组10只，雌雄各半（由四川省中医药科学院实验动物中心提供，动物生产许可证：SCXK[川]2008—19.SPF级）。设1250、2500、5000mg/kg3个剂量组，另设阳性对照组（环磷酰胺40mg/kg）和阳性对照组（蒸馏水）。经口灌胃染毒，按20ml/kg等容量给予，采用30h染毒发，即2次染毒间隔24h，于第二次染毒后6h处死动物，取胸骨髓直接涂片，甲醇固定，Giemsa染色。每只鼠计数1000个嗜多染红细胞（PCE）中出现的微核细胞；并计算嗜多染红细胞（PCE）与正染红细胞（NCE）比值。计算微核细胞率（%）。 2 结果 2.1 稳定性试验结果 试验结果表明，试验浓度柠檬酸水溶液，经密封包装在37℃保存90d，柠檬酸含量下降率2.1%。 2.2 中和剂鉴定试验结果 结果表明，用0.1mol/L磷酸氢二钠水溶液作为中和剂，可有效中和该最高试验浓度柠檬酸水溶液对枯草杆菌黑色变种芽孢的残留作用，且该中和剂及中和产物对棵草杆菌黑色变种芽孢的生长繁殖和培养基无影响。 2.3 杀菌试验结果 结果表明，将浓度为20.68g/L柠檬酸水溶液加温至80℃，协同作用5min、10min和15min，对浸泡在其中的载体上枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭对数值均＞3.00.阳性对照菌片回收菌数对数值范围为6.26~6.29。 2.4 透析机管路模拟现场消毒试验结果 将装入透析机管路中浓度20.68g/L柠檬酸水溶液加温至80℃，循环作用10min，对污染在管路中枯草杆菌黑色变种芽孢的杀灭率均达到100%，10次重复试验结果一致。 2.5 毒性试验结果 急性经口毒性试验结果表明，染毒后观察期间，动物均未出现明显的中毒症状及死亡；动物大体解剖，未见异常改变。试验浓度柠檬酸水溶液对小鼠急性经口毒性LD50值＞5000mg/kg（体重），属实际无毒级。 3 讨论 近年老，血液透析引起的院内感染时有报道，究其原来仍然是血液透析机与透析器消毒不到位，目前国内血液透析后丙型肝炎感染率仍维持在30%~60%。由于目前广泛使用的碳酸氢钠透析液在管路中会产生钙的沉淀，而柠檬酸具有很好的溶解作用，同时柠檬酸为食品添加剂或医药化工原料，毒性低，无刺激性，所以已有学者将其用于血液透析机热消毒程序。研究表明，单方柠檬酸只具备抑菌作用，杀菌力很低，而水温在90℃以下也不具备杀灭细菌芽孢的效果。将柠檬酸水溶液加温，不仅可扩大其杀菌谱，还可明显提高杀菌效果。 本研究效果进一步证明，浓度在20g/L柠檬酸水溶液加热到80℃作用10min即具有很强的杀灭枯草杆菌黑色变种芽孢的作用，在透析器管路内循环作用一个消毒周期，可将管路溶液中枯草杆菌黑色变种芽孢全部杀灭。本研究经毒性试验证明，柠檬酸水溶液为无毒级物质，无致微核作用；同时证明，稍微提到柠檬酸溶液即可明显缩短作用时间。医院的血液透析室如果采用柠檬酸与热力联合作用的方式消毒血液透析机，严格按照科室制定的标准清洗消毒程序操作，应具有良好的消毒效果。 | 
